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在线qpcr引物设计网站解读_rtpcr引物设计网站(2024年12月精选)

内容来源：东为网络所属栏目：新闻更新日期：2024-12-02

在线qpcr引物设计网站

𐟔찟窠物理实验的常用仪器与软件一览在基础物理实验室中，有许多常用的实验仪器和软件，帮助科学家们进行各种实验。以下是一些常见的实验方法和仪器：基因鉴定：包括DNA提取、PCR体系、电泳技术等，用于研究基因敲除鼠、基因敲入鼠和点突变鼠等。石蜡切片/冰冻切片：通过HE染色、免疫荧光和免疫组化等技术，观察细胞和组织结构。 qPCR：包括引物设计、RNA提取、逆转录和qPCR体系配置，用于定量分析基因表达。 Western blot (WB)：从组织样本中提取蛋白质，通过制胶、电泳、转膜、孵抗体和曝光等步骤，检测蛋白质表达。 Elisa：用于微量蛋白或物质的定量分析。细胞实验：包括细胞复苏、培养、传代、冻存、计数、转染以及细胞增殖/毒性实验、迁移实验、成管实验、免疫荧光染色、流式细胞术、细胞能量代谢实验、细胞周期检测实验和细胞凋亡实验等。常用仪器：如离心机、涡旋混匀仪、普通显微镜、荧光显微镜、共聚焦显微镜、酶标仪、PCR仪、荧光定量PCR仪、流式细胞仪和海马仪等。常用软件：包括统计软件如ImageJ、GraphPad Prism和SPSS，文献管理软件如EndNote和Zotero，绘图软件如Draw.io和PS，以及引物设计软件如Primer Premier 5和SnapGene。通过这些仪器和软件，科学家们可以进行各种物理实验，探索自然界的奥秘。

qPCR内参基因跑不齐？可能原因在这里！最近在做qPCR的时候，总是遇到内参基因能跑出来，但目的基因却怎么也跑不出来的情况。CT值要么特别高，要么直接显示“undetermined”。换了几次引物还是不行，真是让人头疼。有没有哪位大佬能帮我解答一下这个问题？内参基因与目的基因的差异 𐟧슊首先，内参基因和目的基因在PCR反应中扮演着不同的角色。内参基因通常用来校正实验条件，确保实验数据的可靠性。而目的基因则是我们真正关心的，希望通过PCR扩增来检测其表达水平。实验条件的影响 𐟧ꊊ有时候，内参基因跑不齐可能是因为实验条件的问题。比如，PCR反应的退火温度、引物的设计、模板的质量等都会影响PCR的结果。你可以尝试调整这些参数，看看是否能改善情况。引物设计的问题 𐟔 引物设计是PCR实验的关键步骤之一。如果引物设计不合理，可能会导致目的基因无法有效扩增。你可以尝试使用不同的引物序列，或者使用在线工具进行引物设计优化。实验操作中的误差 𐟚늊实验操作中的误差也可能导致内参基因跑不齐。比如，加样时的误差、PCR仪的温度控制不稳定等。你可以尝试在实验过程中更加仔细，或者使用自动化设备来减少人为误差。数据分析的问题 𐟓Š 最后，数据分析也可能导致误解。比如，CT值的计算方法、数据的标准化处理等。你可以尝试使用不同的数据分析方法，看看是否能得到更可靠的结果。希望这些建议能帮助你解决qPCR内参基因跑不齐的问题！如果你还有其他疑问，欢迎随时交流讨论。加油！𐟒ꀀ

𐟔점CR定制服务，提供qPCR检测、PCR代做、QPCR定制、引物设计、RNA提取、逆转录、数值分析等服务。 𐟓Š 提供溶解曲线、扩增曲线、柱状图、CT值等实验数据，保证结果真实可靠。 𐟓‹ 保证数据唯一性，确保实验结果的真实性和准确性。 𐟔砥Œ…括引物设计、RNA提取、逆转录等实验步骤，满足您的定制需求。 𐟓ˆ 提供Amplification Plot和Melt Curve Plot，帮助您更直观地了解实验过程和结果。

qPCR原理详解：实时荧光定量PCR 大家好，今天我们来聊聊qPCR（定量多聚酶链式反应）的原理。最近有点抑郁，加上药物作用，每天睡12小时，实在没精力更新。不过还是感谢大家的支持，下周有流式实验，到时候会拍操作界面的照片给大家详细讲解。 qPCR和传统PCR的主要区别在于检测方式。传统PCR只是对基因进行扩增，而qPCR则是实时检测底物的荧光强度来判断mRNA的表达量。这就引入了一个重要的概念：Ct值。在qPCR中，基因的表达与荧光强度并不是线性关系，而是指数级增长（因为DNA的扩增是2^n次方）。因此，在某个循环时，荧光强度会达到一个阈值。当荧光强度超过这个阈值时，我们认为是高表达。到达这个阈值需要的循环数越少，基因的表达量就越高。这就是图2中曲线含义的解释（图片来源：Merck）。有人可能会问，既然是mRNA的表达量，为什么说是DNA的扩增呢？这就要提到mRNA和cDNA的概念。空气中存在RNA酶，所以RNA在正常条件下极不稳定。即使是RNA-seq，也需要将RNA逆转录为cDNA。在生物学中，我们一般认为这两者的表达是一致的。篇幅有限，下次再讲操作流程（RNA提取和引物设计等）。感谢大家的支持。

分子克隆实战指南：PCR篇 𐟔奈†子克隆的目的是构建目的基因重组体，并在细胞中验证其成功过表达。以下是主要流程： 1️⃣ PCR：获取目的基因TP53基因的CDS区（1182bp），通过PCR并经琼脂糖凝胶电泳验证条带，然后胶回收目的基因。 2️⃣ 酶切：将目的基因与载体用特定限制性核酸内切酶切割，暴露粘性末端，并分别胶回收这两部分。 3️⃣ 连接：用DNA连接酶连接暴露粘性末端的目的基因和载体。 4️⃣ 转化：将连接成功的环状产物转化到大肠杆菌感受态细胞。 5️⃣ 涂板：12-16小时后挑菌做菌落PCR验证。 6️⃣ 摇菌：直接摇菌中提（见之前菌落PCR笔记，可以省去小提步骤）。 7️⃣ 提取质粒并测序。 8️⃣ 转染：将质粒转染细胞24小时后（记得要有对照组，即只转染试剂组）。 9️⃣ 提取细胞总RNA。 𐟔Ÿ 逆转录成cDNA。 1️⃣1️⃣ 设计qPCR引物（Primer bank查询即可）。 1️⃣2️⃣ 实时荧光定量PCR检测目的基因TP53。 ⚠️注意事项： 1️⃣ PCR试剂盒选择：实验室之前使用Takara的Primer star高保真酶，后期发现很多国货非常好用，如ATG巨匠生物的ATG 2*Proofast Master Mix，PCR结果稳定，酶高保真且扩增效率高。 2️⃣ PCR程序设定的两个关键问题：退火温度：与引物性质有关，注意设计引物软件中的Tm值不应算上酶切位点和保护碱基，应只含互补配对部分，这时的退火温度才是准确的。理论上一定范围内，退火温度高时，特异性好。所以很多同学碰到有杂带的情况，可以适当提高退火温度；反之，如果条带不出，可以适当降低退火温度。延伸时间：延伸时间与片段长度有关，还与酶的延伸效率有关，可以参见DNA聚合酶的说明书。 3️⃣ 通过胶回收获得的产物是未暴露粘性末端的双链DNA，所以还需要后续的限制性核酸内切酶进行酶切，将载体和目的基因片段都暴露粘性末端，才能进一步连接。

𐟔젒T-PCR实验全攻略：从原理到实践 𐟓š 目录 cDNA与反转录 RT-PCR原理与目的 RNA抽提与质量检测反转录过程 PCR程序与引物设计 PCR酶与体系 PCR产物检测实时荧光定量PCR（RT-qPCR）常见问题与注意事项 𐟔젣DNA与反转录 cDNA（互补DNA）：与RNA链互补的单链DNA。在适当引物的存在下，由DNA聚合酶即反转录酶合成的单链DNA就是cDNA。反转录（Reverse Transcription）：在反转录酶的作用下，以RNA为模板合成DNA的过程。合成的DNA链称为与RNA互补的DNA，即cDNA。 𐟔젒T-PCR原理与目的原理：RT-PCR全称反转录聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction），将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。目的：检测核酸的表达，主要是RNA的表达。DNA不需要反转录的过程，直接PCR检测即可。 𐟔젒NA抽提与质量检测 RNA抽提方法：TRIzol法。主要成分包括苯酚，用于裂解细胞和变性蛋白。 RNA质量检测：分光光度计测定、凝胶电泳法。 𐟔젥转录过程以RNA为模板合成cDNA的过程。在这个过程中，遗传信息的流动方向与转录时相反，因此称为“反转录”。需要反转录酶，合成的DNA称为与RNA互补的DNA（cDNA）。根据不同情况选择不同的反转录引物。 𐟔점CR程序与引物设计 PCR程序：三步法，包括变性、退火和延伸三个基本反应。引物设计：找到目的基因的CDS序列，用软件设计和评价引物，并使用BLAST进行引物特异性检测。引物长度为15-30bp，最常用的为23bp；引物Tm值介于62-73℃之间，上下游引物Tm最好相近以保证其能高效工作；3'-端的Tm值要低于5'端；引物GC含量约为40-60%；避免扩增模板的二级结构域；避免引物的二级结构；避免与靶DNA错配。 𐟔점CR酶与体系 PCR酶：可选择普通的Taq酶、可扩增长片段的Taq酶或高保真酶。 PCR体系：按所选的PCR酶说明书来配制。 𐟔점CR产物检测一般采用琼脂糖凝胶电泳，必要时也可使用聚丙烯酰胺凝胶电泳。 𐟔젥—𖨍祅‰定量PCR（RT-qPCR）基本原理：在PCR体系中加入能够指示DNA片段扩增过程的荧光染料或荧光标记的特异性探针，通过对PCR过程中产生的荧光信号累积或荧光标记的特异性探针释放的荧光信号进行监测和记录，实时监测整个PCR进程，再结合软件对获得的荧光信号数据进行分析，计算待测样品中特定DNA片段的初始量。扩增过程：包括荧光背景信号阶段、荧光信号指数增加阶段和荧光信号平台期阶段。常见问题与注意事项：在进行RT-PCR实验时，需要注意实验条件的选择、引物的设计、RNA的质量控制以及实验操作的规范性等问题，以确保实验结果的准确性和可靠性。

𐟧접PCR的魔法原理揭秘 ✨ 𐟔 你是否好奇QPCR是如何运作的？今天，我们就来揭开这个神秘的面纱！ 𐟌᯸ PCR，即聚合酶链式反应，是一种以DNA为模板，在DNA聚合酶的帮助下，体外合成DNA并不断扩增的过程。而QPCR，即定量PCR，是在PCR体系中加入了荧光染料或荧光探针，通过实时检测荧光信号来监测PCR进程。 𐟒᠑PCR的原理是这样的：在PCR反应中，随着DNA的复制和扩增，荧光信号会逐渐增强。通过检测这个荧光信号的变化，我们可以知道DNA的复制情况，从而对模板进行定量的分析。 𐟓 QPCR的流程包括：RNA提取、逆转录、引物设计、选择内参、模板用量和对照设置等步骤。每一个步骤都至关重要，确保了实验的准确性和可靠性。 𐟌Ÿ 通过QPCR，我们可以更精确地了解基因的表达情况，为生物研究和医学诊断提供了强大的支持！现在，你是不是对QPCR有了更深入的了解呢？

𐟧쒔-qPCR实验室全攻略✨ 𐟔젒T-qPCR，你get了吗？这是分子生物学中的大热门哦！今天，就让我们一起探索它的神秘世界吧～ 𐟒ᠪ*操作指南**： 1️⃣ **引物设计**：引物是RT-qPCR的灵魂，要遵循一般设计原则，并确保产物长度在80-150bp之间，这样扩增效率更高哦！ 2️⃣ **Mix配制**：根据MasterMix、模板和引物的不同进行优化，达到最佳反应体系。注意，MasterMix不要反复冻融，且冰上操作是关键！ 3️⃣ **实时检测**：在PCR扩增过程中，通过收集荧光信号来实时检测。这样，我们可以看到每一个循环的荧光值变化，从而判断扩增情况。 4️⃣ **数据分析**：RT-qPCR的数据分析包括相对定量和绝对定量两种方法。相对定量用于检测实验组和对照组中一个靶基因的倍数差异；而绝对定量则是通过标准曲线来得到目的基因的量。 𐟎‰ **小贴士**： - 实验过程中要严格遵守无菌操作原则，确保实验结果的准确性。 - 每个样品至少设置3个平行孔，以减少误差。 - 在数据分析时，要选择合适的软件和算法，以确保结果的可靠性和准确性。 𐟚€ 现在，你是不是对RT-qPCR有了更深入的了解呢？快来试试吧，相信你一定能够成为RT-qPCR的大师！

如何设计qPCR引物：实用指南大家好！今天我们来聊聊如何设计qPCR（定量PCR）的引物。其实，qPCR的引物设计和普通PCR差别不大，都可以用NCBI来方便地设计。不过，由于qPCR鉴定的是mRNA的表达，所以在设计引物时需要特别注意以下几点：第一步：打开NCBI 首先，打开NCBI（美国国立生物技术信息中心）网站，搜索你需要的基因（例如Lepr）。第二步：找到基因卡片点开基因卡片，找到最下方的mRNA和Protein描述。根据你的需求选择合适的Isoform，然后复制NM码。第三步：进入引物设计页面在NCBI的引物设计（Primer design）栏目输入刚才复制的NM码。我个人更喜欢下载cDNA文件，然后用SnapGene手动拉取引物，这样可以直接看到cDNA序列，更加直观。第四步：确认引物CG值在SnapGene中确认引物的CG值（大约50%），Tm值在60度左右。可以多设计几对引物，以防有些引子不工作。希望这些小技巧能帮到大家，祝科研顺利！𐟒ꀀ

实时荧光定量PCR：Ct值到底有多重要？实时荧光定量PCR（qPCR）是一种在PCR反应体系中加入荧光物质，通过实时监测荧光信号来追踪PCR反应进程的技术。Ct值是qPCR中一个非常重要的概念，它代表了PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所对应的循环数。简单来说，Ct值就是起始模板扩增到一定量时所需的循环数。什么是Ct值？𐟔 在qPCR中，Ct值是扩增产物荧光信号达到阈值时的循环数。这个阈值通常是人为设定的，当扩增产物量达到这个阈值时，循环数就被定义为Ct值。Ct值的计算基于荧光信号的强度，因此它直接反映了起始模板的量。为什么需要Ct值？𐟤” 模板量与Ct值的关系：在PCR的指数扩增阶段，产物量与循环数之间的关系可以用以下公式表示：扩增产物量 = 起始模板量㗠（1 + En）^ 循环数。这里的En是PCR扩增效率，通常在90%-110%之间。 Ct值的设定： qPCR的扩增产物量是通过荧光信号的形式呈现的，即扩增曲线。设定一个荧光信号阈值，当扩增产物量达到这个阈值时，此时的循环数就是Ct值。因此，模板的Ct值与起始拷贝数的对数之间存在线性关系。起始模板量越高，Ct值越小；起始模板量越低，Ct值越大。 Ct值的重现性： Ct值是荧光定量PCR结果的重要呈现形式，用于基因表达量差异或基因拷贝数的计算。一般情况下，复孔Ct值的差值最好不超过0.5，否则结果不可信。在PCR早期，扩增处于理想情况下，循环较少，产物积累少，荧光信号与背景本底难以区分；随着进入指数期，微小误差尚未放大，Ct值的重现性极好。 Ct值的范围与影响因素𐟓Š 扩增效率En： PCR扩增效率是指聚合酶把待扩增基因转变生成扩增子的效率，常用En表示。En的正常范围为90%-110%。影响En的因素有很多，常见的因素包括引物设计、酶活性、反应条件等。 Ct值的范围： Ct值的范围一般为15-35。但是，对于不同的基因，由于起始模板量中基因拷贝数和扩增效率不同，需要做出该基因的标准曲线，计算出基因的线性检测范围以及En。 Ct值异常的原因与解决方案𐟔犥𘸨灧š„Ct值异常原因包括引物设计不合理、酶活性不足、反应条件不当等。解决方法通常包括优化引物设计、更换酶或调整反应条件等。总之，Ct值是实时荧光定量PCR中一个至关重要的参数，它不仅反映了起始模板的量，还直接影响结果的准确性和可靠性。通过了解Ct值的计算方法和影响因素，可以更好地理解和应用qPCR技术。