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内容来源：东为网络所属栏目：导读更新日期：2024-11-27

qrt引物设计网站

qPCR原理详解：实时荧光定量PCR 大家好，今天我们来聊聊qPCR（定量多聚酶链式反应）的原理。最近有点抑郁，加上药物作用，每天睡12小时，实在没精力更新。不过还是感谢大家的支持，下周有流式实验，到时候会拍操作界面的照片给大家详细讲解。 qPCR和传统PCR的主要区别在于检测方式。传统PCR只是对基因进行扩增，而qPCR则是实时检测底物的荧光强度来判断mRNA的表达量。这就引入了一个重要的概念：Ct值。在qPCR中，基因的表达与荧光强度并不是线性关系，而是指数级增长（因为DNA的扩增是2^n次方）。因此，在某个循环时，荧光强度会达到一个阈值。当荧光强度超过这个阈值时，我们认为是高表达。到达这个阈值需要的循环数越少，基因的表达量就越高。这就是图2中曲线含义的解释（图片来源：Merck）。有人可能会问，既然是mRNA的表达量，为什么说是DNA的扩增呢？这就要提到mRNA和cDNA的概念。空气中存在RNA酶，所以RNA在正常条件下极不稳定。即使是RNA-seq，也需要将RNA逆转录为cDNA。在生物学中，我们一般认为这两者的表达是一致的。篇幅有限，下次再讲操作流程（RNA提取和引物设计等）。感谢大家的支持。

如何设计qPCR引物：实用指南大家好！今天我们来聊聊如何设计qPCR（定量PCR）的引物。其实，qPCR的引物设计和普通PCR差别不大，都可以用NCBI来方便地设计。不过，由于qPCR鉴定的是mRNA的表达，所以在设计引物时需要特别注意以下几点：第一步：打开NCBI 首先，打开NCBI（美国国立生物技术信息中心）网站，搜索你需要的基因（例如Lepr）。第二步：找到基因卡片点开基因卡片，找到最下方的mRNA和Protein描述。根据你的需求选择合适的Isoform，然后复制NM码。第三步：进入引物设计页面在NCBI的引物设计（Primer design）栏目输入刚才复制的NM码。我个人更喜欢下载cDNA文件，然后用SnapGene手动拉取引物，这样可以直接看到cDNA序列，更加直观。第四步：确认引物CG值在SnapGene中确认引物的CG值（大约50%），Tm值在60度左右。可以多设计几对引物，以防有些引子不工作。希望这些小技巧能帮到大家，祝科研顺利！𐟒ꀀ

𐟔점CR定制服务，提供qPCR检测、PCR代做、QPCR定制、引物设计、RNA提取、逆转录、数值分析等服务。 𐟓Š 提供溶解曲线、扩增曲线、柱状图、CT值等实验数据，保证结果真实可靠。 𐟓‹ 保证数据唯一性，确保实验结果的真实性和准确性。 𐟔砥Œ…括引物设计、RNA提取、逆转录等实验步骤，满足您的定制需求。 𐟓ˆ 提供Amplification Plot和Melt Curve Plot，帮助您更直观地了解实验过程和结果。

𐟔젒T-PCR实验全攻略：从原理到实践 𐟓š 目录 cDNA与反转录 RT-PCR原理与目的 RNA抽提与质量检测反转录过程 PCR程序与引物设计 PCR酶与体系 PCR产物检测实时荧光定量PCR（RT-qPCR）常见问题与注意事项 𐟔젣DNA与反转录 cDNA（互补DNA）：与RNA链互补的单链DNA。在适当引物的存在下，由DNA聚合酶即反转录酶合成的单链DNA就是cDNA。反转录（Reverse Transcription）：在反转录酶的作用下，以RNA为模板合成DNA的过程。合成的DNA链称为与RNA互补的DNA，即cDNA。 𐟔젒T-PCR原理与目的原理：RT-PCR全称反转录聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction），将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。目的：检测核酸的表达，主要是RNA的表达。DNA不需要反转录的过程，直接PCR检测即可。 𐟔젒NA抽提与质量检测 RNA抽提方法：TRIzol法。主要成分包括苯酚，用于裂解细胞和变性蛋白。 RNA质量检测：分光光度计测定、凝胶电泳法。 𐟔젥转录过程以RNA为模板合成cDNA的过程。在这个过程中，遗传信息的流动方向与转录时相反，因此称为“反转录”。需要反转录酶，合成的DNA称为与RNA互补的DNA（cDNA）。根据不同情况选择不同的反转录引物。 𐟔점CR程序与引物设计 PCR程序：三步法，包括变性、退火和延伸三个基本反应。引物设计：找到目的基因的CDS序列，用软件设计和评价引物，并使用BLAST进行引物特异性检测。引物长度为15-30bp，最常用的为23bp；引物Tm值介于62-73℃之间，上下游引物Tm最好相近以保证其能高效工作；3'-端的Tm值要低于5'端；引物GC含量约为40-60%；避免扩增模板的二级结构域；避免引物的二级结构；避免与靶DNA错配。 𐟔점CR酶与体系 PCR酶：可选择普通的Taq酶、可扩增长片段的Taq酶或高保真酶。 PCR体系：按所选的PCR酶说明书来配制。 𐟔점CR产物检测一般采用琼脂糖凝胶电泳，必要时也可使用聚丙烯酰胺凝胶电泳。 𐟔젥—𖨍祅‰定量PCR（RT-qPCR）基本原理：在PCR体系中加入能够指示DNA片段扩增过程的荧光染料或荧光标记的特异性探针，通过对PCR过程中产生的荧光信号累积或荧光标记的特异性探针释放的荧光信号进行监测和记录，实时监测整个PCR进程，再结合软件对获得的荧光信号数据进行分析，计算待测样品中特定DNA片段的初始量。扩增过程：包括荧光背景信号阶段、荧光信号指数增加阶段和荧光信号平台期阶段。常见问题与注意事项：在进行RT-PCR实验时，需要注意实验条件的选择、引物的设计、RNA的质量控制以及实验操作的规范性等问题，以确保实验结果的准确性和可靠性。

𐟧접PCR的魔法原理揭秘 ✨ 𐟔 你是否好奇QPCR是如何运作的？今天，我们就来揭开这个神秘的面纱！ 𐟌᯸ PCR，即聚合酶链式反应，是一种以DNA为模板，在DNA聚合酶的帮助下，体外合成DNA并不断扩增的过程。而QPCR，即定量PCR，是在PCR体系中加入了荧光染料或荧光探针，通过实时检测荧光信号来监测PCR进程。 𐟒᠑PCR的原理是这样的：在PCR反应中，随着DNA的复制和扩增，荧光信号会逐渐增强。通过检测这个荧光信号的变化，我们可以知道DNA的复制情况，从而对模板进行定量的分析。 𐟓 QPCR的流程包括：RNA提取、逆转录、引物设计、选择内参、模板用量和对照设置等步骤。每一个步骤都至关重要，确保了实验的准确性和可靠性。 𐟌Ÿ 通过QPCR，我们可以更精确地了解基因的表达情况，为生物研究和医学诊断提供了强大的支持！现在，你是不是对QPCR有了更深入的了解呢？

内参基因是什么意思大家好，我想请教一下关于QPCR中内参基因和目的基因的问题。最近我在做实验时发现，内参基因的Ct值一般在29-30之间，而目的基因的Ct值在18-20之间。内参基因的Ct值明显高于目的基因，这让我有点困惑。我查阅了一些资料，发现内参基因通常用于校正实验误差，确保目的基因表达量的准确性。然而，如果内参基因和目的基因的Ct值差异过大，可能会影响实验结果的可靠性。有没有哪位大神能告诉我，这种情况是否正常？如果内参基因和目的基因的Ct值差异大，应该怎么处理？是否需要重新设计引物或者调整实验条件？期待大家的宝贵意见，谢谢！𐟙

荧光定量PCR技术详解：从原理到实践实时荧光定量PCR（qPCR）技术是一种强大的分子生物学工具，它通过荧光染料或标记的特异性探针来追踪PCR产物的积累。随着PCR反应的进行，荧光信号强度与产物量成正比增加。通过收集每个循环的荧光信号，可以绘制出荧光扩增曲线，进而计算待测样品的初始模板量。这项技术广泛应用于DNA和RNA的相对定量、绝对定量和定性分析。 𐟚€ 常见问题解答 1️⃣ 如何选择合适的内参基因？对于常见物种，如mRNA通常使用actin作为内参，而miRNA检测则使用U6。对于特殊物种，建议根据文献选择合适的内参。如果无法确定内参，可以提供内参基因筛选服务，帮助选出稳定的内参。 2️⃣ 引物出现非特异怎么办？可以通过提高退火温度、减少引物量或重新设计引物来解决。 3️⃣ 如何判断扩增曲线是否良好？曲线拐点清晰，特别是低浓度样本的指数期明显。曲线指数期的斜率与扩增率成正比，斜率越大，扩增效率越高。基线平直或略微下降，无明显上扬趋势。各管的扩增曲线平行性好，表明各反应管的扩增效率相近。 4️⃣ 荧光阈值如何设定？在荧光扩增曲线的指数增长阶段设定一个荧光强度标准（即PCR扩增产物量标准）。荧光阈值可设定在指数扩增阶段的任意位置，但需结合扩增效率、线性回归系数等参数综合考虑。 5️⃣ Ct值是什么？在PCR扩增过程中，扩增产物（荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数。Ct值具有极好的重复性。荧光定量PCR技术相比常规PCR，具有更高的特异性、能有效解决PCR污染问题，且自动化程度高，已广泛应用于分子生物学研究和诊断中。

𐟧쒔-qPCR实验室全攻略✨ 𐟔젒T-qPCR，你get了吗？这是分子生物学中的大热门哦！今天，就让我们一起探索它的神秘世界吧～ 𐟒ᠪ*操作指南**： 1️⃣ **引物设计**：引物是RT-qPCR的灵魂，要遵循一般设计原则，并确保产物长度在80-150bp之间，这样扩增效率更高哦！ 2️⃣ **Mix配制**：根据MasterMix、模板和引物的不同进行优化，达到最佳反应体系。注意，MasterMix不要反复冻融，且冰上操作是关键！ 3️⃣ **实时检测**：在PCR扩增过程中，通过收集荧光信号来实时检测。这样，我们可以看到每一个循环的荧光值变化，从而判断扩增情况。 4️⃣ **数据分析**：RT-qPCR的数据分析包括相对定量和绝对定量两种方法。相对定量用于检测实验组和对照组中一个靶基因的倍数差异；而绝对定量则是通过标准曲线来得到目的基因的量。 𐟎‰ **小贴士**： - 实验过程中要严格遵守无菌操作原则，确保实验结果的准确性。 - 每个样品至少设置3个平行孔，以减少误差。 - 在数据分析时，要选择合适的软件和算法，以确保结果的可靠性和准确性。 𐟚€ 现在，你是不是对RT-qPCR有了更深入的了解呢？快来试试吧，相信你一定能够成为RT-qPCR的大师！

研三临近，成果为零？5步帮你逆袭！ 𐟎“ 基本情况：作为中科院的研究生，你的专业是生物与医药。导师的研究方向较为冷门，实验室中几乎每个人的毕业时间都延后了一年，甚至有些人延后了更长时间。 𐟧 个人性格：你发现自己有一个明显的弱点，那就是必须有明确的目标才能保持动力。没有目标，你可能会拖延，甚至回避与导师的接触。实验遇到问题时，你也会选择自己解决，而不是寻求帮助。你的抱怨情绪较高，感性上觉得毕业无望，但理性上又觉得延毕也没那么可怕。 𐟔젥ꌦƒ…况：研一：你花了一年的时间进行培训，但毫无进展，没有阅读文献，也没有制定规划。研二：你进入实验室后开始做实验（到11月），导师给你一个非常冷门的题目。寻找和阅读文献变得非常痛苦，一周只能看3、4篇。开题报告糊弄过去（2月）。在基因组序列和转录组分析（3月-4月中）中，你找到了错误的方向，做了无用功。实验设计讨论和答辩秘书的工作让你感到疲惫，终于开始做实验（5月下）。生信分析一周，也是无用功。6月和7月，你进行了qPCR收集材料和组装质粒（转基因），但一直不成功，得不到预期结果，不停地换引物，最终失败。8月放假一周，质粒组装一周。临近中期检查，你几乎没有任何成果，做实验的时间只有2个月，感到非常沮丧。 𐟏堥奺𗧊𖥆𕯼š在6月和7月，你被确诊为腰椎间盘突出，每周需要去医院两次。尽管每周都向导师提交周报，但你感觉自己做了很多事情，但一汇总却发现几乎没有什么进展。 𐟒ᠥ𛺨𜚊明确目标：制定一个清晰的目标，这将是你前进的动力。积极沟通：与导师保持积极沟通，寻求他们的帮助和建议。调整策略：在实验设计和数据分析上，尝试不同的策略和方法。保持健康：注意身体健康，合理安排时间，避免过度劳累。寻求帮助：不要害怕寻求帮助，与同学、导师或专业人士交流，获取支持和建议。 𐟚€ 总结：尽管面临许多挑战，但你仍然有机会在研三阶段取得突破。通过明确目标、积极沟通、调整策略、保持健康和寻求帮助，你可以逐步克服困难，最终实现自己的目标。加油！

𐟧챭PCR实验问题大揭秘𐟔 𐟔젦 ‡准的qPCR扩增曲线会经历基线、指数和平台期，但实验中可能会遇到各种异常情况。本期将通过案例分析，带你了解常见问题及解决方案！ 𐟒ᠩ—˜1️⃣：无模板控制（NTC）组出现指数扩增？可能是实验室污染或试剂生产过程中的遗留污染。解决方法包括清洁工作区域、确保试剂无污染，并重新制备反应混合物。 𐟓Š 问题2️⃣：早期周期循环数据点记录高噪点？可能是基线调整过早或模板添加过多。建议查看原始数据，调整基线，并确保样品稀释至线性范围内。 𐟎—˜3️⃣：扩增曲线异常、数据不可重复或Cq值晚于预期？可能是PCR反应效率低、引物设计不合理、退火温度过低或模板含有抑制剂。优化引物浓度、退火温度，并重新设计引物。 𐟓ˆ 问题4️⃣：标准曲线斜率或R2值异常？可能是稀释度不准确、标准曲线超出线性范围或数据可变。重新计算标准浓度，制作新控制标准液，并消除极端浓度影响。 𐟏† 问题5️⃣：平台期远低于预期？需结合具体情况分析原因，并采取相应措施。可能是PCR反应效率问题或引物设计不当。 𐟔 通过以上分析，相信你能更好地解决q-PCR实验中的常见问题！记得做好实验记录，为后续分析提供有力支持哦！𐟌Ÿ

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