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cas9靶点序列设计网站解读_cma第三方检测认证(2024年12月精选)

内容来源：东为网络所属栏目：新闻更新日期：2024-12-02

cas9靶点序列设计网站

CRISPR/Cas9基因编辑全流程详解你知道CRISPR/Cas9技术吗？这是一种强大的基因编辑工具，能够在特定DNA位点进行精准编辑。今天，我们来详细讲解CRISPR/Cas9的原理和操作步骤，帮助你更好地理解这项技术。 𐟔 原理 CRISPR/Cas9技术的核心是CRISPR（成簇的规律间隔的短回文重复序列）和Cas9（CRISPR相关蛋白9）两种成分。CRISPR是一段特殊的DNA序列，用于记录病毒入侵的历史，并通过间隔序列存储病毒的DNA片段。Cas9则是一种核酸酶，能够在特定DNA序列上切割双链DNA。在基因编辑过程中，研究人员首先设计一条与目标DNA序列互补的单链RNA引导分子（sgRNA）。这条sgRNA能够携带Cas9蛋白，通过碱基互补配对的方式精确找到目标DNA序列。一旦定位成功，Cas9蛋白就会在sgRNA的引导下切割目标DNA双链，产生DNA双链断裂（DSB）。细胞在修复这些DSB时，可以通过两种主要机制进行：非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR）。在没有同源模板的情况下，NHEJ机制会被激活，导致目标基因被删除或产生插入/缺失突变，从而实现基因的敲除。而HDR机制则允许在DSB处外源DNA模板，实现精确的基因插入或替换。 𐟛 ️ 操作步骤设计sgRNA 选择目标基因中的合适靶点序列。使用专门的软件（如CRISPRDesign Tool）设计sgRNA序列，确保其具有高度的特异性和准确性。制备sgRNA 通过体外转录技术或化学合成方法制备sgRNA。验证sgRNA的纯度和完整性，通常使用凝胶电泳等技术进行。构建CRISPR/Cas9系统将Cas9编码序列和sgRNA序列克隆到适当的载体中，如质粒或病毒载体。确保CRISPR/Cas9系统能够在细胞中稳定表达。转染细胞使用基因转染、电穿孔或病毒介导转导等方法将CRISPR/Cas9系统导入目标细胞。根据细胞类型和转染效率选择合适的转染方法。筛选和鉴定基因编辑细胞使用特定的筛选标记（如荧光蛋白或抗生素抗性基因）富集成功转染的细胞。通过分子生物学方法（如PCR和测序）验证目标基因的编辑情况。筛选出具有目标基因敲除、插入或替换的细胞克隆。功能验证研究编辑后细胞的表型变化和功能影响，如细胞增殖、分化、迁移等。使用流式细胞术、Western Blotting（WB)或免疫组化等技术检测目标蛋白的表达情况。 CRISPR/Cas9技术通过精确识别和切割目标DNA序列，结合细胞自身的修复机制，实现了对基因的敲除、插入或替换。其操作方法包括设计sgRNA、制备CRISPR/Cas9系统、转染细胞、筛选和鉴定基因编辑细胞以及功能验证等步骤。这一技术为基因编辑领域带来了巨大的变化，并在微生物工程等领域展现出广阔的应用前景。

一分钟搞懂基因过表达、敲低、敲除的区别嘿，大家好！今天咱们来聊聊基因操作里的三个常见术语：过表达、敲低和敲除。别担心，只需要一分钟，你就能搞懂它们的区别啦！基因过表达 𐟚€ 基因过表达，简单来说，就是把一个基因插到一个表达载体里，然后把这个载体转染到目标细胞里。这样一来，细胞就会大量表达这个基因和它编码的蛋白质。常见的载体有哺乳动物载体（用于人、小鼠等哺乳动物细胞）、原核载体（用于大肠杆菌等原核生物）和慢病毒载体（比如HIV、FIV、SIV、EIA）。构建这些载体的方法包括设计目的基因片段和载体、连接元件（用酶切或gateway连接），然后通过病毒载体、电穿孔或转染试剂导入目标细胞。基因敲低 𐟛‘ 基因敲低呢，主要是用抑制剂来抑制基因的表达。常见的方法有RNA干扰技术（RNAi）、CRISPR-Cas9技术和gene转染技术。比如，siRNA载体通过与目标mRNA互补结合序列，特异性地实现靶向mRNA降解。而CRISPR载体则包含CRISPR靶向序列和转录抑制子。构建这些载体的步骤包括设计干扰序列、合成和克隆、转化和筛选，最后通过病毒等途径导入目标细胞。基因敲除 ✂️ 基因敲除则是用含有已知序列的小DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合到受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。常见的载体有CRISPR/Cas9载体和TALENs载体。CRISPR/Cas9载体通过Cas9核酸酶和sgRNA靶向序列精确定位并靶向基因DNA序列，然后引入双链断裂点，完成基因敲除。而TALENs载体则包含特异性核酸酶和nuclease binding domain，通过切割靶向基因DNA序列，完成敲除和编辑。构建这些载体的方法包括设计和选择靶点、载体插入、转化和验证，最后通过病毒载体、电穿孔等方法导入目标细胞。总结 𐟓 总的来说，基因过表达、敲低和敲除这三种技术在生物学研究中有着广泛的应用。了解它们的原理和构建方法，可以帮助你更好地设计和执行实验。希望这篇文章能让你在短时间内对它们有个清晰的认识！如果你有任何问题或需要进一步的解释，欢迎在评论区留言哦！𐟘Š

一文掌握细胞增殖的七种方法一、常用的细胞增殖检测方法在细胞增殖研究中，选择正确的检测方法至关重要。以下是几种常用的细胞增殖检测方法及其详细应用说明： 1. MTT实验 MTT实验是一种经典的细胞活力检测方法。其原理基于活细胞中的线粒体脱氢酶可以将MTT（四氮唑盐）还原成紫色甲酚盐。这种变化可以通过分光光度计定量测定，其吸光值的高低与细胞数量成正比。进行MTT实验通常包括以下步骤：将细胞种植在96孔板中，加入MTT溶液后孵育数小时，然后用DMSO溶解形成的甲酚盐晶体，最后测定吸光度。此方法简便、成本低，非常适合初步筛选药物的细胞毒性和细胞增殖能力。 2. BrdU标记法 BrdU（5-溴脱氧尿苷）标记法是一种检测DNA合成，从而评估细胞增殖的方法。 BrdU是胸腺嘧啶的类似物，可以被合成期的细胞掺入新合成的DNA中。通过使用抗BrdU抗体进行免疫荧光染色，可以直观地标记出进行DNA复制的细胞，从而计算增殖细胞的比例。操作时，首先将BrdU加入到细胞培养中，允许一段时间的掺入，然后固定细胞并进行抗体染色。这种方法特别适合于精确的细胞周期分析。 3. 克隆形成实验克隆形成实验是评估细胞生长能力和独立生长能力的重要方法，尤其适用于评估肿瘤细胞的增殖能力。实验过程包括将数量较少的细胞均匀分散在培养板中，长时间培养（一般为1-2周），直到形成可见的细胞克隆。然后用染色剂如克里斯特尔紫对克隆进行染色，计数克隆数量。克隆数量可以反映细胞的增殖能力和生长独立性。这种方法直观且信息量大，适合长期观察细胞的增殖行为。二、细胞培养技术提高细胞增殖率的策略在细胞培养中提高细胞增殖率是许多生物医学研究的关键。通过优化培养条件、使用生长因子以及采用先进的三维培养系统，可以有效地促进细胞增殖。以下是这些策略的详细解析： 1. 优化培养条件培养基成分：细胞增殖需要充足的营养支持。根据细胞类型调整含糖量、氨基酸和维生素的比例，可以显著提高细胞的增殖速度。例如，高糖培养基通常用于高能需求的肿瘤细胞。 pH值：细胞培养的pH值对细胞的生长和生存至关重要。理想的pH值通常在7.2至7.4之间。使用pH指示剂和缓冲系统定期检测和调整培养基的pH值，以保持最适条件。氧气浓度：细胞所需的氧气浓度取决于其原生环境。例如，肝脏细胞和心脏细胞需要较高的氧气浓度，而某些肿瘤细胞则可在低氧条件下更好地增殖。调整氧气浓度，模拟细胞的自然生长环境，有助于增强其增殖活性。 2. 使用生长因子生长因子是调节细胞增殖、迁移和分化的蛋白质或肽。常用的生长因子包括表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）和胰岛素样生长因子（IGF）。这些生长因子通过与细胞表面受体结合，激活细胞内信号转导路径，促进细胞进入增殖周期。在培养基中添加适量的生长因子可以显著提高特定细胞类型的增殖率。例如，在神经细胞培养中添加神经生长因子（NGF）以促进细胞生存和生长。 3. 三维培养系统与传统的二维培养相比，三维培养系统提供了更接近自然生长环境的条件，有助于细胞展现其真实的形态和功能。三维培养使用凝胶、聚合物支架或悬浮培养系统，允许细胞在多个维度上增长，更好地模拟细胞在体内的相互作用和微环境。这种培养方式被发现可以增强细胞的生长活性和药物反应性。三维培养系统特别适合肿瘤学研究和组织工程，因为它们可以更准确地复制肿瘤微环境或组织结构，从而提供更有效的生物模型。通过实施这些策略，研究人员可以有效提高细胞的增殖率，更准确地模拟和研究细胞在生理和病理状态下的行为。三、注意事项 1. 细胞种植密度调控在开始细胞增殖实验前，确保种植的细胞密度适中。过稠的细胞密度会导致细胞之间的竞争，影响细胞的正常生长；过稀则可能影响细胞间的相互作用，减慢细胞增殖速度。建议在实验前进行预试验，找到最优的细胞种植密度。 2. 培养基更换频率定期更换新鲜培养基以供给细胞充足的营养并去除代谢产物，这对于维持细胞的健康增殖至关重要。通常建议每2-3天更换一次培养基，但具体频率应根据细胞类型和增殖速率调整。 3. 精确的时间点记录在进行细胞增殖实验时，准确记录所有关键时间点（如药物处理时间、培养基更换时间等）是必要的。这可以帮助确保实验的一致性，并方便后续实验的复制和数据分析。 4. 细胞传代操作标准化细胞在传代过程中很容易受到操作影响，如细胞暴露在非最佳温度下的时间过长或是酶解时间不当都可能影响细胞的生长状态。建立标准操作流程(SOP)，并严格执行可以减少这种变异。 5. 使用适当的检测方法和仪器校准根据实验设计选择合适的细胞增殖检测方法（如MTT、BrdU等）。确保所有仪器如酶标仪、显微镜等在实验前进行校准，以保证测量数据的准确性。 6. 环境因素控制实验室内环境因素如温度、湿度、光照等都可能影响细胞培养。确保细胞培养室的环境稳定，并监控可能的波动，如CO2浓度和培养箱的温度，避免对实验结果产生不利影响。 7. 实验记录的详尽性在进行实验的每一个步骤，都应该详细记录实验条件、操作变量、所观察到的异常情况等。这种详细记录不仅对当前实验的分析有帮助，对于未来的实验设计改进同样重要。通过这些具体的操作注意事项的执行，可以有效提高细胞增殖实验的准确性和重复性，从而得到更加可靠和有意义的实验结果。四、先进技术在细胞增殖研究中的应用在细胞增殖的研究领域，先进技术的运用正在开创新的可能性，尤其是基因编辑技术和高通量筛选技术。这些技术不仅提高了实验的效率，也极大地增强了研究的深度和广度。 1. 基因编辑技术 CRISPR/Cas9系统：作为一种革命性的基因编辑工具，CRISPR/Cas9允许科学家以前所未有的精确性进行基因操作。通过定向剪切特定基因序列，研究人员可以探索这些基因在细胞增殖中的作用。例如，通过敲除或敲降某些关键的细胞周期调控基因，可以观察到细胞增殖速率的变化，从而揭示这些基因的功能。潜力与应用：在癌症研究中，CRISPR/Cas9被用来鉴定和验证促进或抑制肿瘤细胞增殖的候选基因。此外，这种技术也被应用于基因治疗的开发，目的是修复或替换导致细胞增殖异常的遗传缺陷。 2. 高通量筛选技术技术概述：高通量筛选技术是一种可以同时测试成千上万种化合物或遗传条件对细胞增殖影响的方法。这种技术使用自动化设备和专用软件，能快速评估大量样本中的活性成分，极大地加速了药物发现和发展过程。应用实例：在药物发现中，高通量筛选可用于识别新的抗癌药物。通过评估不同化合物对多种癌细胞线的增殖抑制作用，可以筛选出有效的候选药物。此外，这种技术也用于评价基因靶点的药理学影响，帮助科学家理解基因如何控制细胞增殖。 #广州华韵生物科技有限公司#

CRISPR-Cas9原理与操作全解析 𐟔 CRISPR-Cas9系统的背景 CRISPR是一种在细菌和古菌中发现的基因组序列，这些微生物利用它来抵御病毒的侵袭。Cas9则是一种与CRISPR系统配对的蛋白质，专门负责切割DNA。 𐟔砃RISPR-Cas9的工作原理识别靶位点：细菌的CRISPR基因组包含一系列重复的短序列和间隔序列。这些间隔序列来自过去感染过的病毒DNA，作为记忆来识别和对抗重复的病毒。 crRNA引导：成熟的crRNA与Cas9蛋白结合，形成CRISPR-Cas9复合体。crRNA中的间隔序列与靶DNA序列进行配对识别。靶向结合与切割：CRISPR-Cas9复合体中的crRNA与靶DNA上的相应序列通过碱基配对结合。此时，Cas9蛋白定位于靶DNA区域。Cas9蛋白具有两个切割酶域，分别负责在靶DNA的两个链上产生双链断裂。这种双链断裂在目标位置上产生切口，破坏目标基因的正常功能。 𐟓 操作步骤准备CRISPR-Cas9复合体：将成熟的crRNA与Cas9蛋白结合，形成复合体。识别靶位点：复合体中的crRNA与靶DNA上的相应序列进行配对识别。切割DNA：Cas9蛋白在靶DNA的两个链上产生双链断裂。修复与筛选：通过修复机制筛选出被切割的DNA片段，从而实现基因编辑。通过以上步骤，CRISPR-Cas9系统能够在基因组水平上进行精确的切割和编辑，为生物医学研究和基因治疗提供了强有力的工具。

基因调控全攻略𐟓š 在研究基因功能或验证药物靶点时，基因过表达、敲低和敲除是必不可少的步骤。很多科研人员可能对这些方法感到困惑，因此整理了一些体外细胞实验中常用的过表达、敲低和敲除方法，供大家参考。体内动物的基因编辑将在下一期讲解。基因过表达 𐟓ˆ 基因过表达是将目的基因的编码区序列（CDS）克隆到相应的质粒或病毒载体上，利用载体骨架上的调控元件，使基因在人为控制下大量转录和翻译，从而实现目的基因的过表达。质粒：瞬时转染普通编码基因过表达 miRNA过表达 lncRNA过表达 circRNA过表达特点：过程简单：常规质粒载体通过常规转染即可将质粒转入细胞。载体容量大：有足够大的容量放置感兴趣的序列。表达水平高：表达水平较高。表达时间短：表达时间较短。慢病毒：稳定转染慢病毒重组载体构建完成后需要辅助质粒的参与才能包装形成病毒颗粒。通过对上清液中活体病毒的直接收集或进一步浓缩病毒后可用于转染靶细胞，释放到宿主细胞中的病毒RNA逆转录成双链DNA，进一步整合到宿主细胞的基因组中。感染谱广：感染范围广泛。稳定表达：通过将外源基因整合到宿主细胞基因组上，可实现目的基因长期稳定表达。安全性高：安全性较高。包装容量有限：插入的外源基因需在4kb以下。包装滴度较低：包装滴度较低。基因敲低 𐟓‰ 基因敲低是利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA，从而阻断体内靶基因的表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。通过降解具有同源序列靶基因的mRNA，达到阻止基因表达的作用。 siRNA：瞬时转染小干扰RNA（siRNA），是一类双链RNA分子，长度为20-25个碱基对，类似于miRNA，它干扰了表达与互补的核苷酸序列的特定基因的转录后降解的mRNA，从而防止翻译。基因敲除 ✖️ 基因敲除是用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。 CRISPR/Cas9基因编辑技术 CRISPR/Cas9技术是一种常用的基因编辑技术，通过在基因组中引入特定的DNA片段，实现基因的敲除。希望这些信息能帮助大家更好地理解和掌握基因过表达、敲低和敲除的方法，欢迎交流学习！

质粒那些事儿，必看小技巧！拿到质粒后，首先要确保你拿到的是全序列。最保险的做法是自己测序，至少要把核心区域测了。比如说，一个一万五六千bp的质粒，测个七八千bp的核心区域，也就几百块钱。这样能确保质粒没问题，后面再用也不怕浪费时间和推倒重来。有个网友做木本植物的基因编辑，稳定转化后拿到了100多个抗性芽，但检测不到靶基因编辑。我第一反应就是质粒有问题。建议他去测个序，结果发现cas9上有单核苷酸突变，很可能导致cas9功能丧失，核酸切割能力下降，最后检测不到基因编辑事件。还有一个例子是，有个年轻老师在国外做博士后时，实验室集中力量给一个中国博士做课题，想堆大文章。做到后期发现实验结果和假说反着来，总有些地方说不通。最后确定是质粒出了问题，测序发现质粒有突变。结果前面所有跟质粒相关的实验都得推倒重来，项目进度被大大拖延。那个老师当时又要回国，签证都快到期了，真是惨不忍睹。有些质粒的部分区域没有标出来，可以去NCBI上Blast，总会找到蛛丝马迹，甚至有的会很明确地标出来具体是什么东西。我最喜欢的画质粒图谱的软件是SnapGene，这个软件的厉害之处用过的人都知道，真的非常方便。在动手做质粒相关的实验前，一定要学会如何阅读图谱。看关键区域，每一个元件的作用都要轻车熟路才能去做下一步实验。质粒上的酶切位点，尤其是常用的，都要标出来。有的酶切位点是单个切点，有的有两个甚至多个。哪怕是构建载体这种小实验，也要事先把每一步在理论上都演练一遍，弄得清清楚楚，这样成功的概率才会高，才会真的节省时间。构建载体时建议把方案给有经验的人看看，有时候人是当局者迷，旁观者清。没发现问题最好，发现了问题也可以庆幸自己多留了个心眼。

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